荆芥HD-Zip基因家族的全基因组鉴定及分析

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DOI:10.11833/j.issn.2095-0756.20220390

周佩娜^{1, 2,},
党静洁^{1, 2},
邵永芳^{1, 2},
石遵睿^{1, 2},
张琳^{1, 2},
刘潺潺^{1, 2},
吴啟南^{1, 2, 3,,}

1.
南京中医药大学药学院，江苏南京 210023
2.
南京中医药大学江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏南京 210023
3.
南京中医药大学中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心，江苏南京 210023

基金项目:国家自然科学基金面上项目(81973435)；国家自然科学基金青年科学基金项目(81903756)；江苏省研究生科研与实践创新计划项目(KYCX21_1759，KYCX22_2031)

详细信息

作者简介:周佩娜(ORCID: 0000-0002-5475-3863)，博士研究生，从事中药资源品质评价研究。E-mail:20203098@njucm.edu.cn

通信作者:吴啟南(ORCID: 0000-0001-9730-8279)，教授，从事中药资源生产与品质评价研究。E-mail:wuqn@njucm.edu.cn

中图分类号:Q781；S567

Genome-wide identification and expression analysis of HD-Zip gene family inSchizonepeta tenuifolia

ZHOU Peina^{1, 2,},
DANG Jingjie^{1, 2},
SHAO Yongfang^{1, 2},
SHI Zunrui^{1, 2},
ZHANG Lin^{1, 2},
LIU Chanchan^{1, 2},
WU Qi’nan^{1, 2, 3,,}

1.
College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu, China
2.
Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu, China
3.
National and Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu, China

摘要: 目的鉴定荆芥 Schizonepeta tenuifolia的HD-Zip基因家族，利用生物信息学方法分析其在全基因组中的分布和相关特征以及在不同时期中的表达规律，为该家族基因的进一步研究奠定基础。方法根据已经表征的HD-Zip基因，筛选荆芥基因组内的HD-Zip基因序列，利用MEME、PlantCARE、NCBI、MEGA X、MCScanX、Circos等在线网站及软件对蛋白序列进行基本理化性质分析、进化树构建、染色体定位、基因结构分析、共线性基因分析等。结果在荆芥全基因组中共鉴定到42条HD-Zip基因序列，它们可被分为4个亚家族，分别含有16、7、5、14个基因，亚家族之间的基因长度、结构及保守基序差异显著，但在亚家族内部保守，荆芥基因组与拟南芥 Arabidopsis thaliana基因组共线性分析发现有37对基因，可能具有相似的生物学功能。荆芥的4个亚家族基因的顺式元件中均高频出现了光响应、脱落酸响应、MeJA响应等元件，在不同生长时期的叶片及部位的转录组数据中具有不同的表达趋势，Ⅰ亚家族主要在幼叶中表达，Ⅱ和Ⅲ亚家族主要在根中在表达，Ⅳ亚家族主要在叶中表达。结论在荆芥基因组中共获得42条HD-Zip基因序列，被分为4个亚家族(HD-ZipⅠ~Ⅳ)，亚家族内部高度保守，亚家族之间差异显著，其基因结构、保守结构域及表达模式不同。亚家族Ⅰ和Ⅱ，亚家族Ⅲ和Ⅳ亲缘关系更近，HD-Zip基因具有组织表达差异性，协同调控了荆芥的生长发育和次生代谢。图9表1参25
- 荆芥/
- HD-Zip基因家族/
- 表达分析/
- 系统进化
Abstract: ObjectiveThis study, with the identification of the HD-Zip gene family in Schizonepeta tenuifoliaand an bioinformatic analysis of its distribution and related characteristics in the whole genome and expression pattern in different stages, is aimed to provide a basis for further study of this gene family. MethodGenes in the genome were first screened in accordance with the characterized HD-Zip genes before MEME, Plant CARE, NCBI, MEGA X, MCScanX and Circos were used for the analysis of the basic properties of protein sequences, the construction of Maximum Likeliood (ML) tree, mapping of chromosomes and the analysis of gene structure and colinear gene respectively. Result(1) A total of 42 HD-Zip genes were identified and they could be divided into four subgroups(Ⅰ−Ⅳ), containing 16, 7, 5, 14 genes respectively. (2) The gene length, structure and Motif of the subgroups varied significantly from each though relatively reserved with in each of them. (3) The collinear analysis of the genome of S. tenuifoliaand Arabidopsis thalianashowed that 37 pairs of genes may have similar biological functions with light response, abscisic acid response and MeJA response found in cis-elements of 4 subfamily genes promoters of S. tenuifolia, showing different expression profiles in the transcriptome data of different growth stages of leaves and different parts. (4) The HD-ZipⅠ was mainly expressed in young leaves, HD-Zip Ⅱ and Ⅲ were mainly expressed in roots whereas HD-Zip Ⅳ was mainly expressed in leaves. ConclusionThe total 42 HD-Zip genes obtained from S. tenuifoliagenome were divided into 4 subgroups (Ⅰ−Ⅳ) with highly conserved genes and significant differences among subgroups with their gene structure, motif, and expression pattern being different. HD-ZipⅠ and Ⅱ, and HD-ZipⅢ and Ⅳ are more closely related to each other with HD-Zip genes expressed specifically indifferent tissues and synergistically regulating the growth, development and secondary metabolism of S. tenuifolia. The results of this study provide a bioinformatic reference for the further study of this family’s biological functions. [Ch, 9 fig. 1 tab. 25 ref.]
- Schizonepeta tenuifolia/
- HD-Zip gene family/
- expression analysis/
- system evolution

图 1荆芥HD-Zip基因家族的染色体定位

Figure 1Chromosome mapping of HD-Zip gene family inS. tenuifolia

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图 2荆芥与拟南芥及其他物种HD-Zip基因家族的最大似然值进化树

Figure 2ML evolutionary tree of HD-Zip gene family betweenS. tenuifoliaandA. thalianaand other species

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图 3荆芥HD-Zip基因家族的基因结构分析

Figure 3Gene structure analysis of HD-Zip gene family inS. tenuifolia

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图 4荆芥HD-Zip基因家族的保守基序分析

Figure 4Conservative motif analysis of HD-Zip gene family inS.tenuifolia

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图 5荆芥HD-Zip基因家族的顺式作用元件分布

Figure 5Distribution of cis-acting elements of HD-Zip gene family inS. tenuifolia

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图 6荆芥HD-Zip基因家族的组内串联重复分析

Figure 6Tandem repeat analysis of HD-Zip gene family in genome ofS. tenuifolia

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图 7荆芥HD-Zip基因家族的组内共线性分析

Figure 7Intra-group collinearity analysis of HD-Zip gene family inS. tenuifolia

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图 8荆芥HD-Zip与拟南芥基因组之间的共线性分析

Figure 8Collinear analysis of HD-Zip gene betweenS. tenuifoliaandA. thalianagenomes

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图 9HD-Zip家族基因表达模式

Figure 9HD-Zip family gene expression pattern

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表 1荆芥HD-Zip基因家族的蛋白特征

Table 1.Protein characteristics of HD-Zip gene family inS. tenuifolia

亚家族	基因ID	CDS长度/bp	蛋白长度/个	分子量/ kDa	等电点	染色体	亚家族	基因ID	CDS长度/bp	蛋白长度/个	分子量/ kDa	等电点	染色体
HD-Zip Ⅰ	Sch000003181	900	299	33.847	4.88	Chr 01		Sch000003831	528	175	20.331	8.58	Chr 01
	Sch000016777	897	298	34.379	6.55	Chr 04
	Sch000019486	822	273	31.100	4.59	Chr 04	HD-Zip Ⅲ	Sch000001735	2562	853	93.306	5.74	Chr 01
	Sch000026498	927	308	35.350	5.01	Chr 06		Sch000019857	2511	836	91.461	5.94	Chr 04
	Sch000008725	822	273	31.034	4.83	Chr 02		Sch000014693	2493	830	91.021	5.84	Chr 03
	Sch000005997	912	303	34.369	4.97	Chr 02		Sch000026324	2586	861	94.183	6.14	Chr 06
	Sch000020328	966	321	35.730	4.81	Chr 04		Sch000028231	2529	842	92.434	6.17	Chr 06
	Sch000016424	867	288	32.633	6.32	Chr 04
	Sch000017902	879	292	33.207	6.07	Chr 04	HD-Zip Ⅳ	Sch000026062	2166	721	79.071	5.98	Chr 06
	Sch000002474	876	291	32.531	5.7	Chr 01		Sch000008059	2163	720	79.056	6.23	Chr 02
	Sch000008983	696	231	26.832	6.32	Chr 02		Sch000029960	2181	726	79.526	5.64	HiC_scaffold_8
	Sch000006831	693	230	26.615	6.96	Chr 02		Sch000011892	2418	805	87.913	5.79	Chr 03
	Sch000019278	600	199	22.673	8.44	Chr 04		Sch000009216	2196	731	79.888	5.79	Chr 02
	Sch000021651	546	181	21.788	5.84	Chr 05		Sch000019506	2400	799	87.073	6.04	Chr 04
	Sch000013738	654	217	24.934	7.59	Chr 03		Sch000012322	2490	829	91.502	5.41	Chr 03
	Sch000016710	621	206	24.472	5.44	Chr 04		Sch000012213	2490	829	91.502	5.41	Chr 03
								Sch000004651	2490	829	91.502	5.41	HiC_scaffold_100
HD-Zip Ⅱ	Sch000028530	891	296	327.360	7.52	Chr 06		Sch000018911	2070	689	77.061	6.28	Chr 04
	Sch000010966	879	292	32.623	7.62	Chr 03		Sch000005323	1944	647	73.264	7.27	Chr 02
	Sch000019272	795	264	294.950	8.59	Chr 04		Sch000022402	2307	768	84.180	5.81	Chr 05
	Sch000008316	783	260	29.093	8.12	Chr 02		Sch000024046	2274	757	84.279	6.15	Chr 06
	Sch000025447	879	292	32.351	9.05	Chr 06		Sch000008675	1884	627	69.905	6.18	Chr 02
	Sch000011951	645	214	24.334	8.24	Chr 03
说明：CDS指蛋白编码区

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图(9)/ 表(1)

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中药荆芥是唇形科Labiatae植物荆芥Schizonepeta tenuifolia干燥后的地上部分，有解表祛风、透疹止血等功效^[1]。荆芥的挥发油、黄酮等活性成分被广泛用于医药、食品和化工等领域^[2-3]。

HD-Zip (Homeodomain-leucine zipper protein)基因家族是植物界一类特有的转录因子，在植物的生长发育、适应环境及胁迫应答等方面起到重要作用。HD (Homeodomain)蛋白是由Homeobox(HB)基因编码的高度保守的蛋白质结构域，由60个氨基酸组成。该蛋白中存在1个特征性的三螺旋结构，可以特异结合DNA序列，以此对基因进行调控^[4−5]。此外，HD-Zip基因家族还有1个亮氨酸拉链保守结构域(leucine zipper-loop-zipper，LZ)，这是蛋白形成二聚体所必需的结构。根据蛋白的序列保守性、蛋白功能、基因结构等，将该家族分为4个亚家族：HD-Zip Ⅰ ~Ⅳ^[6]。Ⅰ亚家族主要参与非生物胁迫及环境适应性；Ⅱ亚家族主要与生长素响应相关；Ⅲ亚家族主要参与不同的发育事件，例如顶端分生组织、维管束的发育，还与植物激素调控相关；Ⅳ亚家族主要在植物的表皮中特异性表达，主要调节表皮的分化、毛状体形成等^[7]。

目前，HD-Zip基因家族在多种植物中被鉴定并表征，例如拟南芥Arabidopsis thaliana^[8]、水稻Oryza sativa^[9]、小麦Triticum aestivum^[10]等，但尚未有荆芥HD-Zip基因家族的相关研究。本研究以荆芥的基因组作为基础，利用生物信息学方法系统鉴定荆芥HD-Zip基因家族成员，并对其蛋白质理化性质、染色体定位、基因结构、共线性分析以及不同时期的表达规律进行分析，为今后深入研究荆芥基因家族的功能和调控机制奠定基础。

1. 材料与方法

1.1. 荆芥HD-Zip基因家族序列的获得

基于已知的HD-Zip基因家族的保守结构域，在荆芥基因组数据中进行初步筛选，利用TBtools (v1.98741)的“Blast Compare Two Seqs”，下载的蛋白序列为Query Seq，荆芥基因组的蛋白序列为Subject Seq，设置E-value为10⁻¹⁰进行比对^[11]。根据HD-Zip基因家族在美国国家生物技术信息中心(NCBI)中的比对结果，得到目的基因编码蛋白的保守结构域，使用“Visualize NCBI CDD Domain Pattern”进行保守结构域的可视化。利用在线网站ExPASy ( https://www.expasy.org/ )对蛋白序列的基本理化性质，如氨基酸数目、等电点和分子质量等进行预测。

1.2. 系统进化树构建

在NCBI在线网站上下载已被表征的HD-Zip基因家族的蛋白序列。将经过筛选的荆芥HD-Zip蛋白序列与下载的蛋白序列利用MEGA X进行最大似然 (ML)进化树的构建。选择最优氨基酸替代模型，根据氨基酸模型结果构建ML树，设置bootstrap为1000，partial deletion为80%。利用在线网站iTOL ( https://itol.embl.de/# )对进化树进行美化。

1.3. 基因结构和motif分析

在荆芥基因组中搜索HD-Zip基因在染色体上的具体位置和每条染色体的总长度，利用TBtools中的“Visualize Gene Structure (Basic)”功能，对筛选的基因ID进行基因结构的可视化。利用在线网站MEME ( https://meme-suite.org/meme/tools/meme )对筛选的荆芥HD-Zip基因编码的蛋白序列进行蛋白保守基序预测，设置基序数量为10个，选择“Zero or One Occurence Per Sequence (zoops)”分布基序。采用TBtools中的“Visualize MEME/MSAT Motif Pattern”进行保守基序的可视化处理。

1.4. 染色体定位、顺式作用元件及共线性分析

利用TBtools的“Gene Location Visualize from GTF/GFF”进行基因在染色体分布的可视化。将筛选的基因序列利用TBtools中的“Gene Location Visualize fron GTF/GFF”功能进行染色体定位分析；提取荆芥HD-Zip基因序列的启动子部分(5′UTR上游2000 bp)，利用PlantCARE在线网站( http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/ )预测顺式元件并整理结果，再利用TBtools中的“Gene Structure View (Advanced)”对其进行可视化处理。使用MCScanX软件进行基因组内荆芥HD-Zip基因的共线性分析以及与拟南芥基因组间的共线性分析，并利用Circos软件绘制基因组内和基因组之间的共线性图谱。

1.5. 荆芥HD-Zip基因家族的表达模式分析

根据HD-Zip基因ID于不同时期荆芥叶片(10、20、35 d)及根(35 d)的转录组数据中进行搜索，得到基因的FPKM (fragments per kilobase per million)值，利用TBtools的“HeatMap”绘制基因表达热图，探究HD-Zip基因家族的表达模式。

亚家族	基因ID	CDS长度/bp	蛋白长度/个	分子量/ kDa	等电点	染色体		亚家族	基因ID	CDS长度/bp	蛋白长度/个	分子量/ kDa	等电点	染色体
HD-Zip Ⅰ	Sch000003181	900	299	33.847	4.88	Chr 01			Sch000003831	528	175	20.331	8.58	Chr 01
	Sch000016777	897	298	34.379	6.55	Chr 04
	Sch000019486	822	273	31.100	4.59	Chr 04	HD-Zip Ⅲ	Sch000001735	2562	853	93.306	5.74	Chr 01
	Sch000026498	927	308	35.350	5.01	Chr 06		Sch000019857	2511	836	91.461	5.94	Chr 04
	Sch000008725	822	273	31.034	4.83	Chr 02		Sch000014693	2493	830	91.021	5.84	Chr 03
	Sch000005997	912	303	34.369	4.97	Chr 02		Sch000026324	2586	861	94.183	6.14	Chr 06
	Sch000020328	966	321	35.730	4.81	Chr 04		Sch000028231	2529	842	92.434	6.17	Chr 06
	Sch000016424	867	288	32.633	6.32	Chr 04
	Sch000017902	879	292	33.207	6.07	Chr 04	HD-Zip Ⅳ	Sch000026062	2166	721	79.071	5.98	Chr 06
	Sch000002474	876	291	32.531	5.7	Chr 01		Sch000008059	2163	720	79.056	6.23	Chr 02
	Sch000008983	696	231	26.832	6.32	Chr 02		Sch000029960	2181	726	79.526	5.64	HiC_scaffold_8
	Sch000006831	693	230	26.615	6.96	Chr 02		Sch000011892	2418	805	87.913	5.79	Chr 03
	Sch000019278	600	199	22.673	8.44	Chr 04		Sch000009216	2196	731	79.888	5.79	Chr 02
	Sch000021651	546	181	21.788	5.84	Chr 05		Sch000019506	2400	799	87.073	6.04	Chr 04
	Sch000013738	654	217	24.934	7.59	Chr 03		Sch000012322	2490	829	91.502	5.41	Chr 03
	Sch000016710	621	206	24.472	5.44	Chr 04		Sch000012213	2490	829	91.502	5.41	Chr 03
		Sch000004651	2490	829	91.502	5.41	HiC_scaffold_100
HD-Zip Ⅱ	Sch000028530	891	296	327.360	7.52	Chr 06		Sch000018911	2070	689	77.061	6.28	Chr 04
	Sch000010966	879	292	32.623	7.62	Chr 03		Sch000005323	1944	647	73.264	7.27	Chr 02
	Sch000019272	795	264	294.950	8.59	Chr 04		Sch000022402	2307	768	84.180	5.81	Chr 05
	Sch000008316	783	260	29.093	8.12	Chr 02		Sch000024046	2274	757	84.279	6.15	Chr 06
	Sch000025447	879	292	32.351	9.05	Chr 06		Sch000008675	1884	627	69.905	6.18	Chr 02
	Sch000011951	645	214	24.334	8.24	Chr 03
说明：CDS指蛋白编码区

3. 讨论

本研究从全基因组水平对荆芥的HD-Zip基因家族进行了系统的研究，共鉴定到42个HD-Zip家族的基因，根据识别的DNA序列、结构域、蛋白功能，可将这些序列分为4个亚家族，分别为HD-Zip Ⅰ ~Ⅳ，这与拟南芥、小麦、水稻、玉米Zea mays、土豆Solanum tuberosum、烟草Nicotiana tabacum等中的分类一致^[7-9,13-15]。HD-Zip Ⅰ只含有高保守的HD结构域和位于HD结构域羧基端的LZ结构域；HD-Zip Ⅱ除了HD-Zip Ⅰ具有的HD和LZ保守结构域外，还存在1个高度保守的N-末端；HD-Zip Ⅲ具有HD和LZ保守结构域，以及类固醇合成急性调节蛋白相关的脂质转运结构域(START)和氨基酸序列羧基端的MEKHLA基序，其中START结构域的长度为220个氨基酸且可以结合并转移脂质，MEKHLA基序与许多非生物胁迫应答相关^[16-17]；HD-Zip Ⅳ结构与HD-Zip Ⅲ非常相似，具有HD、LZ、START结构域，但缺失了MEKHLA基序^[18]。荆芥的HD-Zip Ⅰ和Ⅳ亚家族的基因所占比例最高，这与拟南芥HD-ZipⅠ和Ⅳ的比例相似。基因的进化树结果显示：HD-Zip Ⅰ与Ⅱ亲缘关系更近，HD-Zip Ⅲ与Ⅳ亲缘关系更近，由此可以推测以上2个分支可能是由相同的祖先进化而来，或者Ⅳ是由Ⅲ进化来，但在分化过程中丢失了MEKHLA基序^[19]。结合基因的结构来看，HD-Zip Ⅲ和Ⅳ的结构比HD-Zip Ⅰ与Ⅱ的结构更为复杂，以上结果说明可能HD-Zip Ⅲ与Ⅳ相比于HD-ZipⅠ和Ⅱ进化程度更高，基因结构更为复杂，以上结果与保守结构域分析和进化树的分析结果一致。这说明HD-Zip家族在物种的亚群内部较为保守，但其具体的基因功能可能会由于基因复制或者进化，以及物种间的差异性从而出现一定的差异。

分析启动子发现：在每个亚族内部的基因启动子区顺式作用元件类型基本相同，例如MYB结合位点、脱落酸响应元件以及MeJA响应元件在HD-Zip Ⅳ高频出现。同时，同一亚族基因编码蛋白的保守基序也基本相同，HD-Zip Ⅰ ~Ⅳ的表达分析发现：HD-Zip Ⅰ ~Ⅳ具有不同的表达偏好性，说明荆芥中不同HD-Zip家族不同亚家族可能具有不同的生物学功能，但同一亚族各基因的生物学功能基本相同。

有研究表明：HD-Zip Ⅳ在表皮中特异表达，参与植物表皮细胞的分化，调节毛状体(腺毛和非腺毛)等形成与发育。如烟草中的NtHDG2，拟南芥的PDF2，黄花蒿Artemisia annua的AaHD1和AaHD8，番茄Solanum lycopersicum的SlCD2和SlWo均对毛状体具有调控作用，属于HD-Zip Ⅳ^[14,20-22]。本研究中发现荆芥的HD-Zip Ⅳ亚家族基因大部分在叶片表达，推测可能这些基因与毛状体的发育相关。结合拟南芥与荆芥HD-Zip基因家族的共线性分析，可以推测荆芥HD-Zip基因家族的生物学功能。结合文献，发现Sch000029960与AT4G21750.1及AT4G04890.2为同源基因，AT4G21750.1及AT4G04890.2分别编码拟南芥的GL2-like和PDF2，与拟南芥的表皮发育密切相关。Sch000024046与AT1G79840.2为同源基因，AT1G79840.2编码GL2，在拟南芥中影响表皮细胞的特性，包括毛状体、根毛发育等^[23]。在荆芥的叶、茎、花穗等多个部位表面分布着多种腺毛及非腺毛，其中，盾状腺毛即腺鳞被认为是荆芥产生挥发油的“品质载体”^[24-25]，但是调控荆芥腺鳞生长发育的分子机制还未被报道，本研究中筛选的HD-Zip Ⅳ亚基因家族可能为腺鳞发育调控的候选基因。通过对候选基因功能的验证、共表达分析等为腺鳞生长发育分子机制的阐明提供线索，同时为提高荆芥药用品质提供理论基础。

4. 结论

本研究在荆芥全基因水平上筛选到42条HD-Zip基因序列，并对以上序列的基因结构、保守基序、顺式作用元件等进行了分析。系统发育分析可将42条序列分为4个亚家族(HD-Zip Ⅰ ~Ⅳ)。通过与拟南芥基因组之间的共线性分析、表达模式分析等推测，荆芥的HD-Zip Ⅳ亚家族基因可能在毛状体发育过程中起到重要作用。这些结果为后续荆芥的HD-Zip基因家族的功能研究及表征提供了理论基础。

参考文献 (25)

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